激光掃描體視顯微鏡采集的注意事項(xiàng)

激光掃描體視顯微鏡對(duì)于要觀察的區(qū)域，應(yīng)先用明視場(chǎng)顯微鏡和普通熒光顯微鏡進(jìn)行定位，當(dāng)然也可使用共聚焦系統(tǒng)的體視顯微鏡進(jìn)行定位。但對(duì)于大多數(shù)初學(xué)者或非專業(yè)研究人員來說，在只使用共聚焦模式的情況下，常很難找到合適的焦平面。所以應(yīng)該學(xué)會(huì)使用共聚焦系統(tǒng)配備的顯微鏡，以常規(guī)模式預(yù)觀察樣品，因?yàn)橐�在一張含有�?shù)百個(gè)胚胎的標(biāo)本中找出特定發(fā)育時(shí)期的某種基因的表達(dá)非常困難，如直接采用共聚焦模式掃描標(biāo)本，常很費(fèi)時(shí)。許多儀器具備快速掃描功能，可在一定程度上彌補(bǔ)這種缺陷，但在快掃模式下，其分辨率低。因此，當(dāng)尋找少見的現(xiàn)象時(shí)，較容易的方法是使用普通模式觀察切片，一旦發(fā)現(xiàn)即刻切換到共聚焦模式進(jìn)行圖像采集。

成功進(jìn)行共聚焦圖像采集的關(guān)鍵是掌握透鏡NA，針孔大小和圖像亮度之間的互相配合，對(duì)于亮度，應(yīng)以可獲得最佳圖像的最小激光強(qiáng)度為標(biāo)準(zhǔn)，即在保證成像的情況下，激光功率應(yīng)盡可能小。可使用軟件的放大功能放大圖像，并將所得的圖像與高NA物鏡所得的圖像進(jìn)行比較。在體視顯微鏡特定成像參數(shù)的設(shè)定操作時(shí)，應(yīng)在標(biāo)本要觀察的特定區(qū)域以外進(jìn)行，防止有價(jià)值的區(qū)域發(fā)生光漂白。常包括設(shè)定PMT探測(cè)器的增益和背底水平，以及何時(shí)的針孔大小，保證在可接受的分辨率和足夠的反差之間獲得平衡，使用最低的激光功率以避免發(fā)生過多的光漂白。許多儀器具有顏色表，有助于設(shè)定圖像中的正確動(dòng)態(tài)范圍。在8比特系統(tǒng)中，該表將最黑的像素設(shè)定為0.為偽彩綠色，而最亮的像素設(shè)定為255，為偽紅色。增益和背底水平以及針孔的調(diào)節(jié)，使其變化范圍在0-255之間，這種調(diào)節(jié)也可通過肉眼進(jìn)行。但在進(jìn)行實(shí)際圖像采集時(shí)，標(biāo)本的熒光不均勻，可能超出范圍，因此，亮的區(qū)域可能遮蓋暗的區(qū)域。

采集的圖像常儲(chǔ)存在計(jì)算機(jī)的硬盤中，而后再進(jìn)行拷貝。通常在圖像采集過程中，應(yīng)采集盡可能多的圖像，如果需要?jiǎng)h除，可在隨后的圖像處理過程中刪除不滿意的圖像。有時(shí)開始看似不滿意的圖像，在日后的進(jìn)一步復(fù)審中可能變得價(jià)值非凡，因此，在進(jìn)行圖像刪除時(shí)，應(yīng)慎之又慎！要與以前制備標(biāo)本時(shí)各項(xiàng)條件保持一致，再?gòu)?fù)制制備標(biāo)本非常苦難，有時(shí)是不可能的。