在室溫或在4°C恒濕機內完成孵育。每一步驟完成后請將試劑汲除, 但是避免在每一步驟的過程中間讓試樣變亁。

請使用足量的試劑覆蓋試樣(通常為20到50 mL)。

使用10%正常山羊血清(Normal Goat Serum, Calbiochem目錄編號NS02L)孵育20分鐘以抑制免疫球蛋白的非特定結合現象。

在PBS中進行清洗, 更換3次且每次進行15分鐘。

在室溫條件下或者在4°C條件下(隔夜進行), 使用含有1% BSA的PBS溶液孵育初級抗體60分鐘。福馬林固定和石臘包埋切片建議使用隔夜孵育的方法。特定應用的最佳抗體濃度應使用低定法測定; 起始濃度在物質資料表中有給定。

在PBS中進行潤洗, 更換3次且每次進行5分鐘。

在PBS溶液中使用和合適生物素複合的第二步驟抗體孵育45分鐘。特定應用的最佳抗體濃度應使用低定法測定; 起始濃度在物質資料表中有給定。

在PBS中進行潤洗, 更換3次且每次進行5分鐘。

在含有卵白素辣根過氧化酶 (目錄編號 OR03L)的PBS溶液中孵育15分鐘。特定應用的卵白素複合體濃度應使用滴定法測定; 建議起始濃度在物質資料表中有給定。

使用PBS溶液廣泛清洗。

在 TRITON®-PBS溶液中潤洗30秒。

在DAB溶液中孵育5分鐘。然后使用顯微鏡監測。若需要進一步強化染色結果, 請重新置入DAB溶液中多孵育1到5分鐘。

在蒸餾水中進行潤洗。

若有需要請在蘇木紫溶液中進行對比染色1到3分鐘。

利用酒精和二甲苯去水合。

使用光學顯微鏡觀察。